ブログ記事 – フルカラーでの表示 – フローサイト測定に関する適切な試薬と計測器の選定

クリストファー・ロータ博士
フローサイトメトリーの科学者

今月のFlow Mattersブログの記事へようこそ!Generating good flow data starts with picking the right mixture of fluorescent labels to use in your良好な流量データを生成するには、フローサイトメトリーアッセイ(一般的に「パネル」と呼ばれる) and the right type of flow cytometerおよび適切なタイプのフローサイトメーターで使用する蛍光ラベルの適切な混合物を選定することから始まる。When building flow assays, it helps tounderstand how flow cytometers readourmixtures of labels and producethe measurements that we spend so much time poring over during data analysisフローアッセイを構築する際、フローサイトメーターがラベルの混合物をどのように読み取り、データ解析中に長時間にわたって測定を行うかを理解するのに役立ちます。In this post, we’re going to do a deeper dive into the technical side of how biomarkerdetection in flow works and theこの記事では、フローにおけるバイオマーカー検出の仕組みの技術的側面と、実用的なアッセイ設計のための教訓についてさらに詳しく紹介します。

虹の向こう側――フローサイトの生体マーカー検出

As we talked about in our very first blog post, flow cytometersoperate on the principle that each label in apanel is attached to a fluorescent substance最初のブログ記事で述べたように、フローサイトメットは、パネル内の各ラベルが蛍光物質(fluorochrome一般的にはフルオロクロムとも呼ばれる)に結合しているという原理に基づいて動作する。These fluorochromes containone or more can これらの蛍光クロムには、サイトメーターのレーザーから特定の波長(色)の光を吸収し、別の波長の光を放出し、サイトメーターの検出器で捉えることができる、1つ以上の蛍光分子(蛍光体)from the cytometer’s lasers and emit light of another wavelengththat can be captured by the cytometer’s detectorsが含まれている。The precise patterns of absorption and emission for each fluorochromeform its excitation and emission spectra: a distinct set of behaviors that form a recognizable signature in themeasurements collected by our cytometerフッ素クロムの各クロムの吸収と放出の正確なパターンは、その励起スペクトルおよび発光スペクトルを形成する。すなわち、当社のサイトメーターが収集した測定において、識別可能な特徴となる異なる挙動である。The most important characteristics of this signature are the fluorochrome’speak excitation and peak emission wavelengths: the points where it most strongly absorbs and emits light, respectivelyこの特徴的な特徴として最も重要なのは、フッ素クロムのピーク励起波長とピーク発光波長であり、それぞれ光を最も強く吸収し、放出する点である。   

When picking reagents to use in a panel, it is important to use fluorochromes with as unique spectra as possibleパネルで使用する試薬を選ぶ際には、可能な限り独自のスペクトルを持つフッ素クロムを使用することが重要である。By pairing markers to labels with distinct fluorescent signatures, we can more accurately tracethe colors of light emitted by our sample back to theirマーカーを独自の蛍光署名を持つラベルと組み合わせることで、サンプルから放出される光の色をより正確にその由来(s (our labels and biomarkersラベルおよびバイオマーカーの関心)に遡って追跡できます。In a well-designed panel, a cytometer sees a cell like a human might see a rainbow: an array of carefully organized, unique colors that can be easily traced back to their originsよく設計されたパネルでは、サイトメーターが人間のように虹を見る細胞を見る。それは、その起源まで容易に遡ることができる、丹念に整理された独特な色の配列である。 

With that image in mind, you might askその画像を念頭に置いて、虹の大きさ(何色)がサイトメーターを正確に「観測」できるかを問うべきだろう。答え:フローサイトメーターの構築方法によって異なります! 

The first factor that influences a cytometer’s vision is how manyサイトメーターの視覚に影響を与える最初の要因は、レーザー(励起光の異なる色 of excitation light)itis equipped withがどれだけ備わっているかである。The more lasers an instrument has, the more options you have to excite your fluorochromes with, and the better you can separate them based on that behavior装置にレーザーが多く含まれているほど、フッ素クロムを興奮させるための選択肢が増え、その動作に基づいて分離する効果も高くなります。

As a simple example, let’s say we want to build a panel around two biomarkers: one marker for our cell type of interest (i.e CD3 for T cells) and one biomarker associated with the disease context we’re studying (i.e IL-17, an autoimmunity biomarker we discussed last time). We would expect both biomarkers to be found on the same cell at least some of the time, which means we need to pair them with highly distinct fluorochromes.  

Two commonly used fluorochromes that could fit this bill are PE and APC. PE (phycoerythrin) can absorb light from blue or yellow-green lasers (reaching peak excitation at 565 nm) and emits a light red light (reaching peak emission at 578 nm). Allophycocyanin (APC) also absorbs yellow-green laser light but can uniquely absorb red laser light (peak excitation: 640 nm) and emits a darker red light (peak emission: 650 nm). If our instrument is equipped with both a yellow-green and a red laser, these two fluorochromes will be very straightforward to distinguish from one another. When we shine each laser on our cells in turn, we can be very confident that any signal we measure is coming from only our PE label or our APC label.    

Using this same paradigm, we could expand our panel to include additional biomarkers using other distinctly excited fluorochromes, such as BV421 (best excited by violet laser light) and FITC (best excited by blue laser light). While there is some increased chance of misinterpretation for FITC, as PE also can be excited by blue light, we would expect the resolution of our two original biomarkers on PE and APC to be very similar between these 2 and 4 color panels. Success! We’re now collecting more information from our sample without any loss of accuracy – the dream scenario for any assay development scientist. 

What happens if we want to add even more biomarkers, though? What do we do once we run out of lasers on our instrument? 

Conventional cytometers 

The standard instrumentation is stillused in most clinical flow cytometry labs;these are built on the assumption that each fluorochrome in an assay will have a uniquearea of peak 標準的な計測器は、依然としてほとんどの臨床フローサイトメトリー検査所で使用されている。これらは、アッセイに含まれる各フッ素クロムがピーク放出の特異な領域を持つという前提に基づいて構築されている。Each detectorin the instrument isset up with the intention of capturing light fromone of these areas of peak emission装置内の各検出器は、これらのピーク放射領域のいずれかから光を捕捉することを目的として設置される。Individualfluorochromes and their labelsare correspondingly assigned to thematching 個々のフッ素クロムおよびそのラベルは、それに応じて装置内の一致検出器in the instrument (per(検出器ごとに1つのラベル))に割り当てられる。Overlap between the fluorochromes’ emission フッ素クロムの発光スペクトル間のベラップは、報酬と呼ばれるプロセスを用いて数学的に用いられる。compensation. In brief要するに、補償は、各検出器で測定された信号の一部がサンプル内の他のすべてのラベルから来ていると仮定することで、重複に対して補正を補正するassuming that some portion of the signal measured in each detector comesfrom all the other labels in the sample (determined by measuring single–labeled control samples)単一ラベル付き制御サンプルの測定によって決定される)。This confounding signal is subtracted from the total, and theremainder is then assumed to be この交絡信号は合計から引算され、残りは割り当てられたラベルから生じる「真」信号であると仮定される。

This conventional process, while in some ways crude, works very well for small palettes of highly distinguishable colors; think the primary colors of the rainbow, usingこの従来のプロセスは、ある意味では粗雑ではあるが、非常に識別しやすい色の小さなパレットに非常に効果的である。従来の例で、従来の例を用いて虹の原色を考えてみてください。Most conventional instruments are equipped to accurately detect 10-12fluorochromes very robustly, which is sufficient for many clinical assaysほとんどの従来の機器は、10〜1個の2つのフッ素クロムを正確に正確に検出できるように装備されており、多くの臨床アッセイには十分である。By incorporating more detectors and lasers, some systemscan push this number even higher and separate 20-30 distinct fluorochromesより多くの検出器とレーザーを搭載することで、この数値をさらに高く押し上げ、20〜30個の異なるフッ素クロムを正確に分離できるシステムもある。all conventional instruments have very firm ceilings of detectionしかし、ハードウェアに関わらず、すべての従来型機器は非常に厳しい検出の上限を持つ。 The more colors used, the harder it becomes to create and assign unique detectors for every color and the more signal thatmustbe subtracted during compensation, reducing the effective resolution of each biomarker使用する色が多いほど、色ごとに独自の検出器を作成し、割り当てにくくなり、補正中に差し引かなければならない信号量が増えるため、各バイオマーカーの効果的な解像度が低下する。 

スペクトル細胞計

To address these limitations, spectral cytometers were developed to operate on a different principle: instead of assigning one detector to each fluorochrome, these instruments utilizeこれらの制限に対処するために、分光サイトメーターは異なる原理で動作するように開発された。各フッ素クロムに1つの検出器を割り当てる代わりに、これらの装置ははるかに大きな検出器(使用されるラベル数以上 used)visible light spectrum emitted from a sample as accurately as possibleを用いて、試料から放出される可視光スペクトルを可能な限り正確に測定する。whole spectral pattern, rather than solely based on their peak emissionsこの情報は、そのピーク放射値だけに基づくものではなく、そのスペクトルパターン全体に基づいてフッ素クロムを分解するために使用される。Mathematically, this process of spectral unmixing works similarly to compensation buttakes advantage of the increased information gatheredduring acquisition in two main ways数学的には、スペクトル不混合のこのプロセスは報酬と同様に機能するが、取得時に収集された情報の増加を主に2つの方法で活用する。First,spectral unmixing generally produces a more accurate estimate of the true signal for each label まず、スペクトルの不混合は、より多くの検出器から測定値(from more detectors サンプルサイズが大きくなる=誤差が低い)を単に収集することで、各ラベルの真の信号をより正確に推定する。This increased scope allows more highly overlapping labels that would be incompatible in a conventional assayこの拡大された範囲により、従来のアッセイでは互換性のない、より重なるラベルがパネル内で効果的に区別され、効果的に使用されるようになる。

The second advantage of spectral unmixing is that it allows these instruments to スペクトル不混合の2つ目の利点は、これらの機器が細胞から生じる背景雑音 from our cells (オート蛍光とも呼ばれるautofluorescence))をより効果的かつ正確に測定できるようにすることである。For T cells, this signature is easy to read and has little effect on our data; however, for larger, more complex cells, like neutrophils,T細胞にとって、このシグネチャーは読みやすく、データへの影響もほとんどない。しかし、好中球のように大きくて複雑な細胞の場合、特定のフッ素クロム(主に紫外線や紫色の光によって刺激されるものUV or )absorb)を検出する際に大きな障害となる可能性がある。benefit from using a spectral cytometer over a conventional instrument,as the unmixing can “extract” this background noise from the mixture of colors and increase the detection accuracy further for each labelこれらのタイプの細胞が豊富な試料は、従来の装置よりもスペクトルサイトメーターを使用することで恩恵を受けることができる。なぜなら、混合しないことで、色の混合からこの背景雑音を「抽出」し、各ラベルの検出精度をさらに高めることができるからである。

フローサイトメトリーのデータ収集と測定を支える主な原則の概要 

カラフルな結論 

これらの技術的原理を総合すると、フローサイトメトリーが技術として持ついくつかの重要な意味合いがある。 

1. パネルに組み込む追加のバイオマーカーごとに、他のすべてのバイオマーカーの解像度(検出精度)を低減する機会があります

私たちが示したように、完全に独自の励起スペクトルを持つ試薬の使用がもはや不可能であるという状況に到達した。つまり、臨床アッセイにマーカーやラベルを追加することは、データの正確性に常に潜在的な影響を及ぼすということです。6、12、24のマーカーパネルの性能差は、使用するフッ素クロムやバイオマーカーの性質によって非常に大きくなる可能性があるthird blog post(このテーマについてさらに詳しくは、第3のブログ記事を参照)。簡単に言えば、色が多いほど潜在的な問題(およびトラブルシューティング)が増す。パネル作成の際は慎重になり、迷ったときは専門家に相談してください! 

2. 従来の楽器を使っている場合でも、スペクトル全体について考えるのは当然のことです

Conventional instruments might not be built to detect the entire visible light spectrum, but they 従来の機器は可視光スペクトル全体を検出するように設計されていないかもしれないが、それでも実際に観測される。It’s easy to narrow your focus down to just the excitation and emission maxima when building panels and forget that fluorochromes paint in broad strokes, not pointsパネルを作る際に、刺激と発光の最大値に絞って、フッ素クロムが点数ではなく広いストロークで絵を描くことを忘れがちです。Small, unanticipated spectral overlaps often create issues when it comes to compensation, so it’s worth identifying小さくて予期しないスペクトルの重なりは、補償に関して問題を引き起こすことが多いため、早期にそれを特定し、最小限に抑える価値がある。Sometimes fluorochromes’ behaviors can fluctuate due tounexpected reactions between your labels and your cells, so keep a careful eye out during your first experiments フラオロクロムの挙動は、ラベルと細胞間で予期しない反応によって変動することがあります。新しいパネルを使った最初の実験中は、注意深く注意を怠ってはいけません。 

3. 最新のツールや最も強力なツールだけでなく、適切なツールを選びましょう

Be deliberate, not only in how many labels you pick but also whichfluorochrome and instruments you utilize選ぶラベルの数だけでなく、どの蛍光体や楽器を使うかについても、慎重に考えてください。WW hile c onventional cytometers are generally not as flashy or powerful as their spectral counterparts, they are reliable and robust toのオンベンショナルサイトメーターは、一般的にスペクトルの指標ほど派手で強力ではなく、臨床サンプルに内在する多くの変動性に対して信頼性が高く、堅牢である。maintaining their performance can require a steadier逆に、スペクトルサイトメーターはサラブレッド競走馬であり、確かにより強力であるが、その性能を維持するには、ある程度の手が必要となる。Similarly, newer dye classes can offer access to more colors and theoretically improve your panel, but sometimes it can make more sense to use a tried-and-true dye instead that you know works well同様に、新しい染料クラスではより多くの色を利用でき、理論的にはパネルの性能を向上させることができますが、実際に効果がよくわかっているような、実裏の染料を使うほうが、より理にかなっている場合もあります。

Thanks for joining us on this deeper dive intoフローの根本的な側面について、より深い議論を続けていただき、ありがとうございます!we will dive back into a more application-focused topic with multiple myeloma and how flow can be used for minimum 次回は、多発性骨髄腫を用いたより応用重視のトピックと、流量を最小または測定可能な残存疾患(MRD)検出にどのように使用できるかについて改めて説明します。さあ、また会いましょう!

参考文献 

1. ノヴォ・D.フローサイトメトリックデータからのフッ素クロム含有量の計算における、スペクトル不溶解と従来の補償の比較。Cytometryサイトメトリー。2022年;101(11): 885–891。https://doi.org/10.1002/cyto.a.24669