Welcome to our third 第3回Flow Mattersブログ記事へようこそ!the fundamentals of flow cytometry最初の投稿では、フローサイトメトリーの基本と臨床試験におけるその有用性について紹介しました。2つ目の投稿では、この技術が腫瘍学におけるCAR-T細胞免疫療法の開発パイプラインにどのように応用されているかを考察した。次に、適切に設計されたフローサイトメトリーアッセイを作成するプロセスについて探ります。道具やビジョンを持つだけでは不十分であり、そのビジョンを現実のものにするには職人技が求められる。私たちの課題がニーズに適切に適合していない、あるいは適切に検証されていない場合、データを確実に解釈し、必要な臨床的知見を生み出すことはできません。
この記事では、臨床用途における効果的なフローサイトメトリーアッセイを設計するという主要な原則について説明します。アッセイデザインの理論的なステップをただ踏むだけでなく、臨床検査施設での経験から得られた実践的な知見も共有します。
Designデザイン制作 W ith P Pアップス
アンバー・ベイル
フローサイトメトリー サイエンティストアソシエイト
At HBRI, we approach flow cytometry assay design with the mindset of fit-for-purpose: HBRIでは、フローサイトメトリーアッセイ設計に対して、目的に合った考え方を応用しています。それぞれのアッセイは、研究の設計や研究者のニーズを反映するように成形する必要があります。
文脈にかかわらず、すべてのフローサイトメトリーパネルの設計は、明確な科学的問いという同じ基盤から始めるべきである。その質問を実際に思いつく最もよい方法は、デザイナーとしての自分を尋問することから始めることが多い。サンプルや実験システムに関する基本的な質問に答えられないのであれば、私たちのパネルも期待できません。
まず、私たちが取り組んでいるサンプルの種類と、そのサンプルがどこから来ているかを明確に理解する必要があります(Ref1)。患者の疾患状態とその臨床治療は、サンプルの細胞組成および特性に直接影響を与える。たとえば、CAR-T細胞モニタリングにおいては、治療中の特定のがん、使用されているCAR-T細胞の種類、それらの細胞がどのように製造されているか、およびどの細胞相互作用が治療効果において重要であるか(すなわち、PD1/PD-L1シグナル伝達によるCAR-T細胞の腫瘍免疫抑制)を把握することが不可欠である。これらの要因はすべて、アッセイ設計における私たちの選択、すなわちどの細胞集団や行動を追跡する必要があるか、およびどのバイオマーカーがそれらを追跡するのに最も効果的であるかを決定することにつながる。
Naturally, the next question becomes: 当然のことながら、次の質問はこうです。「あなたの関心を持つ人々はどのような存在ですか?」仮説に関連する特定の細胞タイプや細胞サブセットを特定することは不可欠である。細胞のどの広範なカテゴリーを特定する必要があるか(すなわち)T細胞、骨髄細胞)?これらのカテゴリー(つまり、使い古されたT細胞、骨髄由来の抑制細胞)から解析し、注目を浴びるためには、どのような特定の種類の細胞が必要でしょうか?これらの優先順位を早期に特定することで、マーカーとラベルのペアリングに関する意思決定において非常に役立つ実験的フレームワークが生まれる。
Of course, after identifying our populations of interest we should next ask: Which biomarkers will produce the most accurate identification and classification of these populations? Biomarker choice is a question that our team always considers, even in cases where the set of markers is determined in advance by a sponsor. Understanding which markers are expected to be co-expressed by the same cells, for instance, is essential to make sure that we assign these markers spectrally distinct labels. Similarly, knowing the expected cellular dynamics of a marker (whether it is intracellular or extracellular, stable or labile, etc.) affects the staining protocols and panel layout. Lastly, perhaps most important is knowing the expected density of each marker on each cell type: highly expressed proteins often perform best when matched with low brightness labels, while low-abundance targets require brighter ones to ensure accurate detection. We’ll touch on this specific area again later!
After answering all these questions, much like buying a car, we next must select the right “make and model” for our panel and tailor the features to fit the needs we’ve identified.
Step 1: Start Your Engine – Choosing the Best Cytometer for the Job
A great panel isn’t just about the markers, it’s about how well they match your machine.
In general, we have two types of instruments at our disposal for flow cytometry: conventional and spectral flow cytometers. Each has their own benefits and shortcomings for clinical flow cytometry, which we will more thoroughly discuss in a future post, and their utility comes down ultimately to the application.
要するに、従来のサイトメーターは、バイオマーカーのリストがすでに十分に洗練されており、規制要件が厳しく、一貫性が極めて重要である臨床用途において優れた選択肢である。標準化された構成により、検証済みのラボワークフローや品質管理環境への統合が容易になります。一方、スペクトル式フローサイトメーターは、スペクトル的に類似したフッ素クロムを識別する能力が高まったことにより、より柔軟なパネル設計とより深いプロファイリングを可能にする。この増加したパワーにより、アッセイに組み込めるマーカーの数に対してより高い上限が設けられ、サンプルの体積が限られている場合に特に有用である(例えば、小児由来の血液、骨髄の吸引、脳脊髄液)。より大型で探索的なパネルに適しており、将来の研究に役立つサンプルから可能な限り多くの情報を収集することを目指している。ただし、臨床環境におけるスペクトルフローサイトメトリーの導入には、特有の課題が伴う。この技術はまだ比較的新しく、急速に進化している一方で、ワークフロー、試薬の検証、および実験室の標準化が依然として洗練されている(Ref 2)。
In short: conventional flow cytometers offer proven performance; spectral flow cytometers promise greater flexibility and insight. Choosing the right system means balancing current needs with future potential.
Step 2: Light It Up – Picking the Right Fluorescent Labels for your Biomarkers
Now that we’ve chosen our instrument, it’s time to bring the panel to life by picking the best fluorescent labels to pair with our biomarkers.
Think of it like a love story, success depends on the characteristics and chemistry of both partners. There are countless fluorochromes available, each with unique traits: brightness, spectral spillover, stability, and size all play a role. On the marker side, we already discussed some of the important principles earlier (co-expression patterns, density, and cellular localization) and this step is where they come from. The goal is to find pairs that complement each other and balance our overall mixture of labels and markers to produce the best possible blend (Ref 1,3).
Historically, finding that blend required a lot of manual calculation and searching. These days, there are tools available that can perform that process much faster (i.e., EasyPanel, Fluorofinder; Ref 4,5). These offer helpful suggestions and are a great place to start, especially for designing a panel from scratch. However, in practice, getting the blend just right still requires refinement and iteration from us as scientists.
たとえば、オンラインツールが紙上でより理想的に見える、より新しいまたはより珍しい蛍光色素を選ぶ場合、すでに過去のアッセイで安定した性能を示しているフッ素クロムの組み合わせをより効率的かつ信頼性が高い場合があります。また、ほとんどの臨床検査機関では、よく知られたベンダーから調達され、ロットと呼ばれる大量のロットで製造された試薬を優先し、定期的な作業作業において安定した可用性と信頼性の高い性能を確保することが一般的である。
また、場合によっては、同じ疾患領域や対象集団に対して、すでに同様のパネルが存在する可能性がある。まったく新しいパネルを設計するのではなく、パネルのバックボーンと呼ばれる既存の基本マーカーを適応させ、構築することが望ましい。このアプローチは、特に前のパネルがすでに最適化され、堅牢なデータを生成することが示されている場合に、連続性の利点を提供する。
パネル設計は技術的な課題であるだけでなく、戦略的な判断であると考えています。革新の約束と経験の力を両立します。
ステップ3:テストドライブをスキップしないでください! – テスト、微調整、繰り返し
「完璧なパネル」を設計したことで、患者の検体に塗布する前にテストを行うことが不可欠です。最も慎重に計画されたパネルであっても、実際には異なる動作ができる(Ref3)。このプロセスにおける重要なステップは、しばしば滴定と呼ばれる適切な抗体濃度を決定することである。抗体とフルオロクロムの併用が以前に同じ集団で成功裏に用いられた場合、その性能はすでに証明されているため、通常同じ濃度を使用できます。しかし、新しい組み合わせであれば、標的細胞を完全にラベル付け(最適な飽和度)で、最も明確に不確実な細胞から識別する濃度(最適な解像度)を検出するために、異なる濃度を試験する必要がある。次に、各試薬の最適な濃度を組み合わせることで、代表的なサンプルに対してパネルの完全な「道路検査」を行います。
これらの実験の結果を解釈することは、単に濃度を最適な個人パフォーマンスで選択するだけにとどまらない。これは、各フッ素クロムがパネル内の他のものとどのように相互作用するかを理解することについてです。たとえば、細胞型は試験中に予想以上に特定のバイオマーカーを発現させる可能性があり、他のチャネルへの波及効果が高まり、その後他のマーカーの解像度が低下する可能性がある。このような場合、パネル全体の性能を最大限に高めるために、「最適以下」の濃度を使用するか、あるいはペアリングを完全に再評価する必要がある場合がある。
In short: 要するに、パネル設計を信頼しつつ、使用開始前に常に性能を確認してください。
目的に合ったアッセイ設計プロセスを一目で確認できます
フローサイトメトリーパネルの設計プロセスにおけるこの短い道のりにご参加いただき、ありがとうございます!次回は、臨床研究の現実世界でこのプロセスがどのように機能するかについて、いくつかのケーススタディを紹介します。今後の投稿で、このプロセスの個別ステップについて改めて検討し、さらに詳しく検討していきますので、どうぞご期待ください!
参考資料:
- シディキ、S.、リヴァーク、F.(2023)。高度フローサイトメトリの原理:実用的な指針。Methods in Molecular Biology, 2580, 89–114. 分子生物学における方法、2580、89–114。https://doi.org/10.1007/978-0716-2740-2_5
- ブレストフ、J.R.(2023)。臨床検査室におけるフルスペクトラムフローサイトメトリー。International Journal of Laboratory Hematology, 国際実験室血液学ジャーナル、45(S2)、44–49。https://doi.org/10.1111/ijlh.14098
- フェレールフォント、L.、スモール、S.J.、リーワー、B.、ピルキントン、K.R.、ジョンストン、L.K.、パーク、L.M.、ランニガン、J.、ジェイムス、M.C.、および価格、K.M.(2021年)。フルスペクトラムフローサイトメトリーを用いた高次元免疫フェノタイピングアッセイのパネル最適化。Current Protocols, 現在のプロトコル、1(9)、e222。https://doi.org/10.1002/cpz1.222
- フッロロファインダー。 Flow Cytometry Panel Designフローサイトメトリパネル設計。フローサイトメトリーパネル設計 I フッ素ファインダーツール
- イージーパネル。The Essential Automation Package for Flow Cytometristsフローサイトメトリスト向けの必須自動化パッケージ。Easypanel – モダンサーバーコントロールパネル
