マティアス・デ・デッカー
フローサイトメトリー上級研究員
Flow Mattersフローマターズブログへようこそ!flow cytometry前回は、堅実な臨床フローサイトメトリーアッセイを構築する上での必須事項を検討しました。今月は、これらの原理を実際の臨床研究の実施にどのように応用できるかを詳しく検討します。具体的には、自己免疫性について述べるとともに、自己免疫疾患に関する臨床研究においてフローサイトメトリーが果たす役割、およびこれらの研究の生物学的文脈がフローアッセイ設計にどのように影響するかについて述べる。
自己免疫とは何ですか?
自己免疫疾患は、現代医学において最も複雑で困難な疾患のいくつかを示している。乾癬やリウマチ性関節炎から多発性硬化症、炎症性腸疾患に至るまで、自己免疫疾患は世界中で何百万人もの人々に影響を及ぼし、ほぼすべての臓器系に影響を及ぼす可能性がある。症状や重症度はさまざまであるが、いずれも免疫システムという共通の基礎となる関連性を持っている。
Normally, our immune systems defend the body against pathogens and other foreign invaders; in autoimmunity, these defenses become overactive and mistakenly target the body’s own tissues. This misfiring can be triggered by a variety of factors, including genetics, environmental influences, infections, and dysregulated signaling by immune cells. In the case of the latter, this signaling is often mediated by an important class of molecules called cytokines.
Cytokines are secreted proteins that help regulate and coordinate immune responses. Think of them as short messages cells can exchange with each other: grow, migrate, attack, defend, etc. Based on the types of cytokines present in their local environment, immune cells adjust their activity accordingly to stay in concert with the body’s needs. In autoimmune disorders, the balance of these messages becomes disrupted, causing immune cells to become continuously mobilized to attack (a condition referred to as chronic inflammation). Eventually, they start to attack anything in sight, even other normal cells.
Within autoimmunity, TNF (tumor necrosis factor) is one of the most well-known pro-inflammatory cytokines and plays a central role in diseases like rheumatoid arthritis and Crohn’s disease. Interleukins 1 and 6 (IL-1 and IL-6) also contribute by promoting fever, inflammation, and the activation of immune cells. IL-6 additionally can stimulate T-helper 17 cells (Th17), one of the major T cell subsets involved in the inflammatory response. Th17 cells are some of the most active T cells in the context of autoimmunity and uniquely produce IL-17, another cytokine that further fuels tissue inflammation and is closely tied to psoriasis and multiple sclerosis disease progression. Finally, IL-12 and IL-23 are supporting factors that can drive and sustain the activity of both Th17 cells and more conventional Th1 cells, keeping them going long after the initial inflammation response dies down.
In recent years, new types of treatment for autoimmune diseases have emerged that specifically aim to modulate components of these signaling responses:
- Monoclonal antibodies are immune cell-derived proteins that bind and neutralize their targets. When aimed at disease-causing cytokines or their receptors, they can dampen pro-inflammatory signaling and reduce inflammation as a result.
- Fc fusion proteins combine a receptor fragment with the Fc portion of an antibody to block inflammatory signals, for example, by acting as decoy receptors for cytokines.
- Small molecule inhibitors, such as JAK inhibitors, work intracellularly to disrupt signaling pathways involved in immune activation.
- CAR T cell therapies, which we discussed in a previous post, have recently begun to be developed for the treatment of autoimmune disorders like lupus. These CAR T cells aim to deplete aberrantly active normal immune cells, targeting them in a similar fashion to cancerous immune cells using markers like CD19.
これらの治療法は、従来の免疫抑制剤と比較して、免疫システムに対してより正確な制御を提供し、多くの自己免疫疾患における結果の改善と副作用の最小化を実現します。
If all of this sounds complicated, that’s because it is! To make it easier, let’s take rheumatoid arthritis as an example. During rheumatoid arthritis progression, overactive macrophages secrete pro-inflammatory cytokines such as IL-6. IL-6 binds to its receptor (IL-6R) on Th17 cells, promoting their proliferation and activation. Activated Th17 cells then produce large amounts of IL-17, which amplifies joint inflammation and eventually contributes to the cartilage and bone degradation that is a common hallmark of the disease. All these steps in the pathway to disease progression present opportunities for intervention that are being actively explored in clinical studies, as illustrated in Figure 1 below.
図1
図1:自己免疫疾患の発症および新たな治療メカニズムの代表的なモデルとしてのリウマチ性関節炎。この経路における重要なポイントを標的とする新たな治療法:IL-6標的Fc融合タンパク質は、Th17の活性化を低下させるためにIL-6デコイとして作用する。抗IL-17モノクローナル抗体(mAb)はIL-17を中和して炎症を抑える(B)。また、小分子のJAK阻害剤はJAKを介したSTATリン酸化を阻害し、IL-17遺伝子の転写(C)を抑制する。
自己免疫疾患臨床試験におけるフローサイトメトリー
免疫調節不全への理解が深まるにつれ、免疫応答を研究するための正確なツールを求める声が高まる。この文脈において、フローサイトメトリーは欠かせない技術となっている。
自己免疫の文脈において、フローサイトメトリーは作用機序と薬物力学的反応の両方について重要な洞察を提供する。以下はいくつかの重要なアプリケーションです:
- Baseline immune profiling: ベースライン免疫プロファイリング:治療開始前に、フローサイトメトリーを使用して患者の免疫状態を評価する。これには、疾患の重症度や治療的反応を予測する可能性のある免疫細胞の不均衡を特定することが含まれる。
- Biomarker development:バイオマーカーの発生:Tヘルパー17(Th17)細胞の増加や制御性T細胞(Treg)の数の減少といった免疫バイオマーカーは、治療効果を評価するために、時間の経過とともにモニタリングすることができる。さらに、疾患の進行に関与する炎症性または制御性のサイトカインの変化は、治療効果や疾患活性に関する貴重な知見を提供する可能性がある。
- Safety monitoring:安全性のモニタリング:自己免疫療法、特に生物学的製剤や免疫調節剤は、免疫の抑制や過剰活性化を引き起こす可能性がある。フローサイトメトリーは、試験中における免疫細胞サブセットの変化をモニタリングすることで、標的外効果を検出するのに役立っている。
- Patient stratification: 患者の階層化:独自の免疫シグネチャを特定することで、研究者たちは特定の治療法の恩恵を受けやすいサブグループに患者を分類し、個別化医療のアプローチを支援できる。
これらの用途における堅牢なフローサイトメトリーアッセイの開発には、再現性、感度、および疾患メカニズムとの関連性を確保するために、綿密な計画が必要である。先月のブログで強調されたように、生物学および治療的文脈への深い理解は、アッセイ設計に情報を提供する上で不可欠である。たとえば、研究対象の薬剤がサイトカイン受容体を標的とする場合、その薬物が標的にどの程度効果的に結合するかを確認するために、受容体占有率(RO)のアッセイが望まれる可能性がある。ROアッセイデザインの重要な側面は、エピトープ選定である。アッセイ構築中は、抗体を慎重に選定し、遊離(結合しない)受容体の測定を可能にする治療薬と競合するか、または薬物結合の有無にかかわらず、特定の非競合エピトープに結合して全受容体レベルを定量化できるようにしなければならない。
さらに、バイオマーカーの優先順位を知るだけでなく、これらのバイオマーカーが細胞内にどこにあるかも検討する必要がある。サイトカイン(例:IL-17、TNF)や転写因子(例えば、トレグのFOXP3やJAK/STATシグナル伝達経路の成分など)の細胞内マーカーの検出が望まれる場合、細胞を固定し、透過化して抗体が細胞膜および核に浸透できるようにしなければならない。サンプル処理のこれらの手順は、エピトープの完全性を維持しつつ、堅牢な信号品質を維持するために、慎重に校正されなければならない。過固定は蛍光強度やマスクのエピトープを減少させることができるが、固定不足は細胞の損失や透過性の悪さを引き起こす可能性がある。固定は背景信号を増加させることもでき、十分に明るいフッ素クロムを選択し、適切な補償管理を行い、分析戦略を調整して、正母と負の集団を明確に分離できるようにすることが重要である。
その他の一般的な重要なステップには、最適なマーカー・フルオロクロムの組み合わせの選定、臨床サンプルを厳密に模倣する条件下での抗体の刺激、および実際の条件下で完全な染色パネルを検証すること(blog post #3, Principles of Clinical Flow Assay Designブログ記事#3「臨床フローアッセイ設計の原則」で説明したとおり)が含まれる。これらの測定は、臨床意思決定および試験エンドポイントに適した高品質で解釈可能なデータを生成する上で極めて重要である。
図2
図2:自己免疫臨床試験のためのフローサイトメトリーパネル開発。
将来を見据える
自己免疫疾患は、その複雑さとばらつきゆえに、非常に大きな課題となっている。フローサイトメトリーは免疫システムへの窓を提供し、研究者が疾患活動の追跡、治療効果のモニタリング、および臨床試験の加速を可能にします。免疫プロファイリングの力を活用することで、自己免疫疾患を抱える人々に対して、より安全で効果的かつより個別化された治療法の開発に一歩近づきます。
新しい技術、例えばスペクトルフローサイトメトリーや質量サイトメトリー(CyTOF)が登場するにつれ、研究者たちはさらに多くのパラメータを同時に解析でき、免疫の複雑さについてより深い知見を得ることができる。単一細胞ゲノミクスと機械学習と組み合わせることで、フローサイトメトリーデータは自己免疫薬の開発においてさらに大きな役割を果たす可能性があり、細胞の知見を臨床的なブレークスルーへとつなげるのに役立つ。
Flow Mattersフローマターズブログの最新記事をぜひお読みいただき、ありがとうございます!自己免疫研究や臨床試験に携わっている場合、フローサイトメトリーアッセイを慎重に設計することで、意味のあるデータを生成する上で大きな違いが得られます。質問や経験を共有できますか?ぜひお聞かせください!
